Real Time Pcr

سلام بچه ها .

با فرض بر اینکه همتون بر طبق پست های قبلی وبلاگ یه سری اطلاعات زمینه ای در مورد pcr پیدا کردید یه کم در مورد real time pcr  میگم .... امیدوارم خوب و کافی باشه چون سعی می کنم خلاصه باشه ....اگر بشه :(

کاربردهای real time pcr  :

.1) تعیین تعداد کپی از هر ژن

2) سنجش میزان بیان ژن 

3) سنجش ویروس ها

4) اندازه گیری میزان آسیب به DNA

5) پیگیری نتایج پیوند عضو

6) پیگیری نتایج، پس از پیوند سلولهای بنیادی خونساز

7) بررسی انواع تریزومی

8) تشخیص سرطان در حین عمل جراحی

9) تشخیص قبل از تولد و تعیین جنسیت با استفاده از سلولهای جدا شده از خون مادر

و بسیاری موارد دیگر .

تو تکنیک Real-time PCR، برای تعیین غلظت DNA از رنگهای فلورسانس و یا شاخص های الیگونوکلئوتیدی فلورسانس  استفاده میشه.

تعیین غلظت DNA با استفاده از رنگهای فلورسانس :

در این تکنیک از رنگهایی استفاده میشه که پس از اتصال به ساختار دو رشته ای DNA (double-stranded:ds)، نور فلورسانس منتشر میکنند. بنابر این در طی واکنش PCR، به موازات افزایش غلظت DNA، میزان فلورسانس در محلول افزایش می یابد. با اندازه گیری شدت نور فلورسانس در انتهای هر سیکل، نهایتا یک منحنی بدست می آد. سپس با استفاده از نمودارهای استاندارد، غلظت DNAی هدف در نمونه مورد مطالعه محاسبه میشن. لازم به ذکر است که رنگهایی نظیر SYBER GREEN به تمام انواع DNAی دو رشته ای، ازجمله محصولات غیر اختصاصی PCR و حتی دایمرهای پرایمر(primer drimers ) نیز متصل میشن و این موضوع موجب کاهش اختصاصی بودن (Specificity) در نتایج حاصل میشه.

تعیین غلظت DNA با استفاده از شاخص های الیگونوکلئوتیدی فلورسانس :

در تکنیک Real-time PCR، دقیقترین و قابل اعتمادترین نتایج با استفاده از شاخص های گزارشگر فلورسانس بدست می آید که البته هزینه زیادی نیز در بردارد. در این روش از شاخصهای DNA یا RNA ی اختصاصی (sequence-specific RNA or DNA-based probe) استفاده میشه و در نتیجه در DNAی هدف، جستجو و تعیین غلظت برای سکانسهای خاص امکانپذیر میشه. بنابر این حتی در حضور سایر انواع DNA، نتایج حاصل از نظر اختصاصی بودن، در حد بالائی است. در این شرایط، چنانچه از شاخصهای اختصاصی با رنگهای مختلف استفاده شه، حتی میتوان ژنهای متعددی را در یک واکنش PCR، مورد بررسی قرار داد.

  پروب‌ یا کاوشگر :

‌‌

قطعهِ خاصی‌ ازDNA رو  که‌ متعلق‌ به‌ توالی‌ از یک‌ ژن‌ خاص‌ یاcDNA  هست، بوسیله آنزیمهای‌ برشی‌ خاص‌ هضم‌ و قطعات‌ حاصل‌ در حاملهایی‌ پلاسمید که‌ توسط‌ همون‌ آنزیم‌محدودگر برش‌ داده‌ شده‌اند جاگذاری‌ میشه . این‌ پلاسمیدها جهت‌ تکثیر و نگهداری‌ به‌ باکتریهای‌آزمایشگاهی‌ که‌ اغلب‌ اشریشا کلی‌ هستند منتقل‌ می‌شن. کلونهای‌ یاد شده‌ توسط‌ رادیو ایزوتوپها یامواد شیمیایی‌ چون‌ بیوتین‌ نشاندار می‌شن. در صورت‌ وجود همگنی‌ ردیف‌ بازی‌ مشابه‌ بین‌ پروب‌وDNA هضم‌ شده‌ اتصال‌ بین‌ این‌ دو برقرار میشه.

خلاصش این که به هر سیکل نور تابانده میشه و  توی آزمایش هایی که نیاز به طراحی prob داریم وقتی prob    را وارد می کنیم در آخر برای دوباره دو رشته ای کردن DNA  ، پرایمر forward  از سمت راست رشته به سمت چپ پیش میرود و در محل برخورد به prob  ها کم کم باعث هضم آنها میشود ، prob  نشان دار شده برای اینکه تحت تاثیر نور syber green  دائم از خودش نور ساطع نکنه و آزمایش دچار اختلال و خطا نشه از واحدی به نام کوآنچر استفاده میشه که با جذب نورها از ساطع شدن اونها جلوگیری می کنه ، تا جایی که با برخورد پرایمر FW  به اون باعث آنالیز شدن و جدا شدنش میشه که با جدا شدن کوآنچر تازه نورهای ساطع  شده بعد از نور syber green  منتشر شده و قابل رویت میشه .

 .

بچه ها توی این کارگاه طراحی prob  و primer  ها رو یاد میگیرن که دیگه توضیح نمیدم تا ایشالله خودتون یاد بگیرید...و همین طور اصطلاحاتی مثل dimer و loop که بهتره تو آزماشات این دو تا ایجاد نشن .

حالا بماند که در مورد پرایمرها نکات مختلفی از جمله دما و طول و ... وجود دارد که همه خیلی مهمن و ایشالله تو کارگاه ها به اهمیتشون پی میبرید.

علاوه بر همه ی اینها با آزمایشات Tag man  آشنا میشیم و سر و کار داریم ، راستی تا یادم نرفته توی این کارگاه real time  با انواع نرم افزارها مخصوص این کارهم سرو کار داریم به  خصوص واسه طراحی و تست همون پرایمر ها و prob  که گفتم که با همشون و نحوه ی کاشون آشنا میشم ...

 حالا تو این کارگاه ما efficiency رو هم اندازه میگیریم که در واقع همون میزان بازده ماست . در حالتی که میزان تکثیر در هر cycle  نسبت به  cycle  قبل ، دو برابر دو برابر باشه ، یعنی : 2 ____    16 _____  8 _____ 4 _____ 32  ...

به این efficincy 100%  میگیم .

هرچقدر efficiency  ما 100% باشه زودتر به هدف  میرسیم و اگر نباشه با مشکل روبه رو میشیم حتی ممکن نتونیم ژن های سالم رو از بیمار تفکیک کنیم .

برای رسیدن به پاسخ در  real time pcr  بهتره این مراحل رو تا 30 cycle  انجام بدیم اما بیشترش باعث خطاست چون هم امکان داره پرایمرها تمام بشن ،  هم امکان داره بر اثر تحلیل نیمه عمر سلول ها و یا کاهش واتمام سایر مواد pcr  و ... ، میزان efficincy  ما 100% نباشه ، یعنی دو برابر دو برابر نباشه ، مثلا 1.9 برابر ، 1.8 برابر ، 1.7 برابر و ... باشه .

.

.

.

.

.

کلی مطالب مهم دیگه هم هست مثل آشنایی با نمودار زیر :

مثل تفسیر نمودار زیر :

مثل کار با دستگاه هایی مشابه دستگاه زیر :

و کلی مطالب مفید و جالبه دیگه .......... همش رو نمیشه اینجا گفت چون کارو کاسبی ملت کنسل میشه ......

اگه جالب بود براتون حتما توی این کارگاه ها شرکت کنید ...