ژن درمانی راهی به سوی پیشرفت پزشکی

معرفی:

خاموش کردن اختصاصی بیان ژن‌‌ها توسط فرآیند تداخل RNA (RNA interference) یا  RNAiیک مکانیسم تنظیم بیان ژن‌ها می‌باشد که در سطح پس از نسخه‌برداری در سلولهای یوکاریوتی اعمال می‌شود. این پدیده که توسط مولکولهای دو رشته‌‌‌ای RNA بنام مولکول‌های RNA مداخله‌گر کوچک (small interfering RNA) یا siRNA واسطه‌گری می‌شود از لحاظ تکاملی در میان موجودات یوکاریوت حفظ شده‌‌ است و بنظر می‌رسد که جهت حفاظت ژنوم در مقابل تهدیدات ژن‌های با منشاء خارجی (اگزوژن) نظیر ژن‌های ویروسی وترانسژن‌ها و همچنین ژن‌های با منشاء داخلی نظیر عناصر ژنتیکی متحرک مثل ترانسپوزون‌ها بکار می‌رود. علاوه بر این فرآیند تداخل RNA در برنامه‌های سلولی جهت تنظیم بیان ژن‌ها و کنترل رشد و نمو سلولی نقش دارد.

تاکنون سه شکل از فرآیند تداخل RNA که از لحاظ فنوتیپی متفاوت ولی از جهت مکانیسم عمل یکسان و مشابه‌اند در یوکاریوت‌ها شناسایی شده است. این اشکال شامل هم‌سرکوبی (Cosuppression) یا خاموش شدن ژن پس از نسخه‌برداری

 (Post-Transcriptional Gene Silencing) یا PTGS در گیاهان، فرونشانی ژن‌ها (Quelling) در قارچها و تداخل RNA (RNA interference) یا RNAi در سلسله‌ی جانوری می‌باشند.

تاریخچه:

پدیده خاموشی ژن با واسطه RNA دو رشته‌ای (dsRNA-mediated gene silencing) نخستین بار در گیاهان در سال 1990 توسط Napoli و همکاران‌اش بطور اتفاقی طی تحقیقی بر روی گل‌های اطلسی ترانسژن (transgenic petunia) کشف گردید. در این بررسی دانشمندان با استفاده از ورود ترانسژن‌های اگزوژن به درون سلول‌های گیاه، گیاهان نوترکیبی را تولید کردند به این امید که میزان پیگمانتاسیون و تولید رنگدانه را افزایش دهند. اما با ورود ترانسژن‌های اگزوژن نتیجه مورد انتظار حاصل نشد به گونه‌ای که بسیاری از گل‌ها دارای فنوتیپ رنگارنک و بعضی بدون رنگدانه بودند وگل‌های بی‌رنگ بجای ارغوانی حاصل شد. متعاقب این مطالعات واژه‌ی هم‌سرکوبی (Cosuppression) برای توصیف خاموشی همزمان بیان mRNA های اندوژن و اگزوژن توسط Jorgenson معرفی شد. بعدها پدیده‌های مشابهی در قارچ‌ها، حشرات، انگل‌ها، موش و رده‌های سلولی انسانی گزارش شد. در سال 1997 Cogoni و Macino پدیده مشابهی را در قارچ نوروسپورا کراسا (Neurospora crassa) مشاهده کردند و آن را یک سازوکار دفاعی ضد ویروسی از سوی قارچ دانستند. در قارچ نوروسپورا کراسا پدیده هم‌سرکوبی ژن‌ها با عنوان فرونشانی (Quelling) نامیده می‌شود. با این وجود کشف قطعی پدیده تداخل RNA زمانی صورت گرفت که Andrew Fire و Craig Mello سرگرم توجیه خاموشی غیر منتظره ناشی از حضور RNA سنس (senseRNA) بودند و در پی آن در سال 1998 نقش حیاتی مولکول RNA دو رشته‌ای در خاموش شدن اختصاصی توالی ژن‌ها در نماتود کانورابدیتیس الگانس (Caenorhabditis elegans) تشخیص داده شد. فایر و همکاران‌اش موفق به اثبات این موضوع شدند که به هنگام هدف قرار دادن اختصاصی نسخه mRNA یک ژن در نماتود  C. elegans، تزریق مولکول‌های dsRNA قادر است حداقل تا ده برابر اثر خاموشی قویتری را در مقایسه با مولکول‌های senseRNA و یا antisenseRNA به تنهایی القا کند. این مشاهده منجر به حصول این نتیجه شد که تزریق dsRNA اختصاصی با منشاء خارجی به بدن نماتود به گونه‌ای بسیار کارآمد سبب پاسخ خاموشی اختصاصی ژن هدف در بدن این موجود می‌شود. این پدیده نوظهور، تداخل (RNA interference) RNA یا همان RNAi نامیده شد. این پدیده در دیگر موجودات یوکاریوتی اعم از جانوران، گیاهان و انسان به خوبی مورد مطالعه قرار گرفت و سازوکارهای آن شناخته شده است. هم اکنون، تکنیک تداخل RNA به عنوان ابزاری توانمند و کاملاً شناخته شده مورد توجه زیست شناسان و محققان رشته پزشکی می‌باشد. در سال2002، زمانی که مجله Science کشف پدیده تداخل RNA را بزرگترین پیشرفت علمی سال نامید، محققان دریافتند که این کشف ارزشمند علمی طی سال‌های آینده چهره تحقیقات حوضه زیست‌پزشکی (Biomedical research) را متحول خواهد ساخت.

مکانیسم عمل و زیست شناسی فرآیند تداخل RNA:

تداخل RNA به عنوان جدید ترین و کارآمد ترین ابزار خاموش کردن اختصاصی بیان ژن‌ها در سطح پس از نسخه‌برداری

(Post-tarnscriptional level) شناخته شده است و در حال حاضر بهترین روش جهت مطالعه‌ی معکوس ژنتیک

(Reverse genetics) در مقایسه با روش‌های قدیمی‌تر خاموش کردن ژن‌ها می‌باشد. نتایج تحقیقات زیادی در این زمینه نشان می‌دهد که این روش بسیار اختصاصی عمل می‌کند و راه‌اندازی چنین سیستمی در قیاس با سایر سیستم‌های غیر فعال‌سازی ژن‌ها ساده‌تر و ارزان‌تر است.

برای مکانیسم عمل فرآیند تداخل RNA یک مدل دو مرحله‌ای ارائه شده است که شامل دو مرحله‌ی شروع (Initiation step) و مرحله‌ی عمل‌کننده (Effector step) است. در مرحله‌ی شروع مولکول‌های RNA دورشته‌ای به طول حدوداً 500-200 جفت باز توسط فعالیت ریبواندونوکلئازی آنزیم‌هایی از خانواده RNase III به نام Dicer (DCR)  و Dicer-like، با مصرف ATP به قطعات کوچک 23-21 نوکلئوتیدی به نام RNAهای کوچک یا کوتاه مداخله‌گر

(small or short interfering RNA) و یا siRNA که به عنوان RNAهای راهنما (guide RNA) عمل خواهند کرد، شکسته می‌شوند. اعضای خانواده آنزیم‌های RNase III جزء معدود نوکلئازهایی هستند که فعالیت اختصاصی برای مولکول‌های dsRNA دارند و آنها را در انتهای 3’ به گونه‌ای برش می‌دهند که 3-2 نوکلئوتید بطور آویزان (overhang) باقی می‌ماند و انتهاهای 5’ و 3’ هیدروکسیله ایجاد می‌کنند. این نوکلئازها از نظر تکاملی در کرم‌ها، مگس سرکه، قارچ‌ها، گیاهان و پستانداران کاملاً حفظ شده‌اند. سپس در مرحله‌ی عمل‌کننده هر کدام از قطعات siRNA در یک مجموعه پروتئینی به نام کمپلکس خاموش‌کننده القاء شده توسط RNA (RNA-induced silencing complex) یا RISC وارد می‌شوند. سپس RISC با فعالیت هلیکازی وابسته به ATP، دو رشته siRNA را از هم باز می‌کند. در این مرحله RISC فعال ‌شده و به همراه مولکول siRNA تک رشته‌ای که دراین هنگام به آن antisenseRNA نیز می‌گویند و مکمل ناحیه‌ای بر روی مولکول RNA هدف (target RNA) و یا senseRNA می‌باشد، به سمت mRNA هدف راهنمایی می‌شود. سپس زیر واحد اندوریبونوکلئازی موجود در ساختار RISC، mRNA هدف را از وسط می‌برد و در نهایت mRNA بریده شده (احتمالاً بوسط اگزوریبونوکلئازها) بطور کامل تخریب می‌شود و سبب خاموش شدن بیان ژن هدف می‌شود.

منابع مختلف dsRNA جهت شروع فرآیند RNAi:

همان‌طور که می‌دانیم حضور مولکول‌های RNA دو رشته‌ای بلند جهت شروع فرآیند تداخل RNA مهم و حیاتی می‌باشد. این مولکول‌های dsRNA از منابع ذیل و به طرق مختلف می‌توانند وارد سلول شده و فرآیند تداخل RNA را راه‌اندازی کنند:

1-   ممکن است از روی لوکوس‌های ژنی بازآرایی شده  (Rearranged loci)رونویسی شوند.

2-   از طریق نسخه‌برداری ژن‌های دارای پروموتورهای همگرا (Converging promoters).

3-   توسط تزریق ترانسژن‌های با توالی تکراری معکوس (Inverted repeat transgenes)، که ابتدا در هسته‌ی سلول به صورت مولکول‌های RNA دو رشته‌ای سنجاق‌سری (hairpin dsRNA) نسخه‌برداری شده و پس از ورود به سیتوزول به dsRNA تبدیل می‌شوند.

4-   از طریق نسخه‌برداری از روی عناصر قابل انتقال همچون ترانسپوزون‌ها که در ژنوم اکثر سلول‌های یوکاریوتی وجود دارند و می‌توانند نسخه‌هایی از ژن‌ها را برای هر دو رشته تولید کنند. این رشته‌ها به صورت سنس و آنتی‌سنس رونویسی شده و سپس به یکدیگر اتصال یافته تا مولکول dsRNA تشکیل دهند.

5-   توسط رونویسی از روی mRNA هدف بوسیله‌ی آنزیم RdRP (RNA-dependent RNA Polymerase) میزبان یا ویروس.

6-   بعضی از ویروس‌های حاوی RNA و حتی حاوی DNA طی مراحل تکثیرشان به طور طبیعی می‌توانند مولکول RNA دو رشته‌ای تولید ‌کنند.

7-   می‌توان مولکول‌های dsRNA را به طور سنتتیک در خارج از سلول تولید و سپس به طرق مختلف به سلول تزریق کرد (Injection of synthetic dsRNA).

8-   گاهی نیز طی فرآیندی به نام تداخل RNA گذرا (Transitive RNAi) توسط آنزیم RdRP که در برخی از سلول‌های گیاهی و قارچ‌ها وجود دارد، از روی mRNAهای هدف نسخه‌برداری شده و مولکول‌های siRNA ثانویه

siRNA)  (secondary تولید می‌شوند.

9-   تولید مولکول‌های siRNA به وسیله‌ی ورود ناقل‌های DNA همچون پلاسمید‌های باکتریایی و وکتورهای ویروسی (retrovirus and adenovirus-based systems) به درون سلول.

سیستم‌های انتقالی و تحویل‌دهنده siRNA به درون سلول :(Transfection and delivery systems)

از روش‌های مختلفی جهت انتقال مولکول‌های siRNA به درون سلول‌ها استفاده می‌شود. مهم‌ترین و رایج‌ترین روش‌های انتقال شامل موارد ذیل می‌باشد:

1-   با استفاده از یکسری محلول‌های شیمیایی به نام معرف‌های آلوده‌کننده (Transfection reagents)، همچون Lipofectamine 2000، Oligofectamine، TransIT-TKO (Mirus)، Ambion’s Siport Amine and Siport.

2-   با استفاده از روش الکتروپوراسیون (Electroporation)

3-   تزریق به سلول با روش Microinjection

4-   از طریق تجویز داخل وریدی کپسول‌های لیپیدی حاوی siRNA (Lipid-encapsulated siRNA)

5-   تحویل و هدایت siRNA به سلول توسط آنتی‌بادی‌های اختصاصی نوع سلول (Antibody-directed)

6-   با استفاده از سیستم‌های تحویل‌دهنده بر پایه فن‌آوری نانو و ذرات نانو(Nanoparticle-based siRNA delivery)

کاربرد‌های تحقیقاتی و درمانی فرآیند تداخل RNA:

با ظهور دانش زیست‌شناسی مولکولی، عملکرد بسیاری از ژن‌ها با مطالعه فنوتیپ ژن‌های جهش‌یافته (Forward genetics) تا حدی مشخص می‌شد و سر نخی از عملکرد ژن مورد نظر به دست می‌آمد. اما با اختراع پروژه‌های تعیین توالی در مقیاس گسترده، هزاران ژن در موجودات گوناگون بدون اینکه عملکردشان مشخص باشد شناسایی شدند. امروزه با استفاده از دانش ژنتیک معکوس، که در حال حاضر کارآمدترین روش ارزیابی نقش و عملکرد ژن‌ها می‌باشد، عملکرد بسیاری از ژن‌های تعیین توالی شده، مشخص شده است. چندین روش مولکولی که در ژنتیک معکوس جهت هدف قرار دادن ژن‌ها مورد استفاده قرار گرفته‌اند عبارتند از: روش نوترکیبی همسان (Homologous recombination) که روشی وقت‌گیر و گران است، استفاده از الیگونوکلئوتیدهای آنتی‌سنس (antisense oligonucleotides) و فن‌آوری رایبوزیم (Ribozyme technology). این روش‌ها علیرغم اینکه در دانش ژنتیک معکوس مفید بوده‌اند اما دارای محدودیت‌هایی نیز می‌باشند. اما با ظهور فن‌آوری تداخل RNA و بکارگیری RNAهای کوچک مداخله‌گر یا همان siRNA جهت خاموش کردن بیان هر ژنی

technonlgy) knockdown (Gene، انقلاب بزرگی در دانش ژنتیک معکوس حاصل شده است.

بر طبق آخرین تحقیقاتی که در زمینه منشاء بسیاری از بیماری‌ها از جمله اختلالات التهابی و سرطان‌های خاص انجام گرفته‌است، اساساً اغلب این بیماری‌ها و ناهنجاری‌ها، منشاء ژنی (gene-based) دارند. برای مثال در درمان بسیاری از سرطان‌ها از جمله سرطان روده بزرگ (colon cancer)، سرطان سینه، انواع کارسینوماها، انواع لوسمی‌ها و سرطان پانکراس، با سرکوب بیان ژن و یا ژن‌های دخیل در ایجاد بدخیمی توسط فرآیند تداخل RNA، موفقیت‌هایی حاصل شده است. همچنین در درمان بسیاری از عفونت‌های ویروسی و انگلی نیز با بکارگیری سرکوب بیان ژن در سطح پس از نسخه‌براری با استفاده از مولکول‌های siRNA، از تکثیر و پیشرفت عفونت جلوگیری به عمل آمده است. برای مثال با سرکوب ژن Vif که یک ژن تنظیمی در ویروس HIV-1 می‌باشد، از همانندسازی و تکثیر ویروس ممانعت به عمل آمده است. علاوه بر این در درمان برخی از عفونت‌های باکتریایی همچون پنومونی و شوک عفونی (septic shock) نیز از این تکنیک با موفقیت‌ استفاده شده است (جدول 1).

جدول 1- برخی از ژن‌های ویروسی که توسط siRNA مورد هدف قرار گرفته‌اند.

کاربرد فرآیند RNAi در درمان عفونت‌های باکتریایی:

پروکاریوت‌ها خصوصاً باکتری‌ها به دلیل اینکه اکثراً خارج سلولی‌اند و در خارج سلول تکثیر پیدا می‌کنند و فاقد مکانیسم RNAi می‌باشند، اصولاً تحت تاثیر خاموشی ژن‌ها توسط فرآیند تداخل RNA قرار نمی‌گیرند. اما این امکان وجود دارد که بتوان با سرکوب بیان آن دسته از ژن‌هایی که در تحریک بیش از حد سیستم ایمنی منجر به پاسخ‌های ناخواسته می‌شوند، میزان مرگ و میر عفونت‌های باکتریایی را کاهش داد. برای مثال می‌توان با سرکوب بیان ژن‌های مسئول در تولید سایتوکین‌های پیش‌التهابی و التهابیcytokines)  (pro-inflammatory and inflammatory، همچون IL-1 و TNF-α که در ایجاد شوک عفونی نقش بسزایی دارند، پاسخ ایمنی میزبان را کنترل کرد بدون اینکه در توسعه‌ی پاسخ ایمنی حفاظتی خللی ایجاد شود. در مطالعه‌ای که در سال 2006 توسط Yanagihara و همکاران‌اش در ژاپن انجام شد این محققان توانستند با استفاده از مولکول‌های اختصاصی siRNA تا حدود زیادی موجب سرکوب بیان ژن مسئول در تولید آنزیم کوآگولاز استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متی‌سیلین (MRSA) شده و قدرت آسیب‌زایی این باکتری را در یک مدل موشی عفونت ریوی به شدت کاهش دهند.

در خاتمه بایستی اذعان کرد که علاوه بر کاربردهای دیگر فرآیند تداخل RNA در جنبه‌های مختلف تحقیقات پایه از جمله ژنومیک عملکردی (Functional genomics) و تایید اهداف دارویی جدید (Drug target validation)، فن‌آوری سرکوب بیان ژن توسط siRNA می‌تواند به عنوان یک گزینه درمانی کارآمد جهت پیشگیری و مهار پروسه‌های بیماری‌زایی عفونت‌های میکروبی خصوصاً عوامل بیماری‌زای مقاوم به چند دارو مورد توجه روز افزون قرار گیرد.

منبع : www.kafil.blogfa.com/